尊龙凯时 人胚肺成纤维细胞MRC5培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人胚肺成纤维细胞MRC5
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）
培养体系：MEM + 10% FBS + 1% NEAA + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺 + 1% P
传代方法：首次建议采用1:2的比例进行传代
备注：在传代后2天需更换培养基，可使用无菌离心管收集培养基，以便进行对比培养。如对比效果不佳，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理调整

收到细胞后，应将其培养至良好状态，并灌满完全培养液后封好瓶口，这是运输细胞的最佳办法。首先使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，再进行后续处理。同时需进行显微镜观察，拍摄不同倍数的细胞生长情况（最好拍摄40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，不提供照片的情况下默认收到状态良好。（传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自行配制的完全培养基，以便进行对比培养，换液后请将瓶盖稍微松开。）

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

如果细胞未达到80%汇合度，则需要将培养瓶中的完全培养液收集至离心管，保留5ml培养基并放入37℃、5% CO2培养箱中培养。如果细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察。若细胞大部分变圆并开始脱落，迅速带回操作台，轻敲几下培养瓶，加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱继续培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞收缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，进行1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中。如需将细胞转入液氮罐中，需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清后，用5ml完全培养基重悬，并接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会因贴壁不牢而出现脱落现象，这是正常情况。如脱落细胞较多，可将培养瓶中的培养液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养。然后沉淀细胞后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后，加5ml完全培养基终止反应。再进行离心，弃去上清后加入1-2ml完全培养基重悬，最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题的重发情况及判定标准：
1. 运输途中出现问题（如细胞丢失、瓶体破损、培养液严重漏液等），可重发。
2. 细胞污染问题需在收到产品48小时内提出真实实验结果，经核实后可重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后或干冰发货的细胞在复苏后24小时，如果绝大多数细胞未存活（需要提供真实清晰的细胞状态照片），可重发。
4. 干冰发货细胞在复苏后24小时或常温发货细胞静置4小时，且未开封的情况下出现污染，亦可重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提出实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经过核实可重发。
6. 收到细胞当天及第2、3天请拍照，3天未告知的情况视为产品合格。4-7天内出现问题的，需要提供前3天照片及操作步骤，与技术人员沟通后，相关责任由技术人员判定，自我方责任将予重发。

2）细胞出现问题不予重发的情况：
1. 客户造成的细胞污染，不予重发；
2. 客户因不当操作导致细胞状态不佳，不予重发；
3. 使用非本库推荐的培养体系导致细胞状态不佳，不予重发；
4. 细胞状态不佳且未提供细胞培养前3天的照片，不予重发；
5. 细胞培养中进行其他处理的不予重发；
6. 收到细胞后2天内未告知的情况，不予重发；
7. 根据具体情况而定。