尊龙凯时为生物医药领域提供优化的RNA提取解决方案，以下是一些常见问题及其解决方法。

总RNA提取

酚-CHCL3抽提法

在RNA提取过程中，样本如果保存不当会导致RNA降解。推荐使用新鲜的组织或细胞样本，避免对冻存样本进行反复冻融。同时，样品在离开活体或原生环境后，内源RNase会开始降解RNA，其速度与RNase的含量及温度相关。您可以将新鲜组织浸泡在RNAKeeper Tissue Stabilizer（Vazyme #R501）中，以室温保存一周、4℃保存一个月或在-20℃/-80℃长期保存。

样本量过大会导致裂解不完全，从而影响RNA的提取效率。此外，过长时间的保存可能导致RNA降解。建议对提取的RNA进行纯度和完整性检测，并在-80℃长期保存或-20℃短期保存，并尽快使用，避免反复冻融。

当RNA提取时发现基因组DNA污染，需在加入CHCL3后，在低温（2℃-8℃）下进行高速离心。离心后，RNA会被转移到上层水相中，而中、下层则为有机相及DNA。如果在常温下离心，可能会导致上层水相中含有少量基因组DNA。小心吸取上层液体以避免污染。

柱式提取法

若遇到gDNA-Filter Columns堵塞问题，可能是样品用量过多。此试剂盒适用于提取10-20mg动物组织或2-5×10⁶个细胞，过多的样本会影响产量及纯度。处理样本时推荐使用液氮研磨以减少堵塞。此外，如研磨不充分，碎片可能导致柱堵塞。建议先对裂解液进行13,000×g离心5分钟，获取上清液，再加入gDNA Filter Columns。

RNA提取不到或产量低的问题可能源于样本保存不当、液氮研磨不充分或洗脱不充分。应使用新鲜样本或液氮速冻储存于-70℃。洗脱时，使用RNase-free ddH₂O滴加至纯化柱膜中央，若洗脱效果不佳，可在室温放置更长时间，进行第二次洗脱。

RNA降解

RNA的降解可能与样本质量、是否受RNase污染以及操作方式等有关。避免样本在收集后未及时保存，建议液氮速冻后保存于-70℃。样本应分成小块以防止反复冻融带来的损害。确保电泳槽和操作中所用的耗材均为RNase-free，以减少污染可能。

下游实验结果优化

若洗脱后的RNA中存在盐离子或乙醇残留，应进行两次Buffer RW2洗涤，若仍有残留，建议室温放置5分钟后再离心，以确保彻底去除。对于DNA污染，考虑使用试剂盒提供的DNase I进行膜上消化，或者选择含有基因组去除模块的逆转录试剂，如尊龙凯时推荐的HiScript® III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（Vazyme #R323）。

逆转录反应

逆转录试剂盒内的gDNA wiper Mix能去除RNA中的基因组残留，尽管不去除基因组也不会干扰逆转录反应的进行，但残留严重可能会影响下游定量实验的准确性。延长逆转录时间可能有助于提高某些高GC模板的转录效率，但对一般模板并无显著效果。

荧光定量PCR问题

若标准曲线线性关系不佳，检查加样误差和模板浓度是重点。CT值若出现太晚，可能因扩增效率过低、模板浓度不足、产物过长等原因。针对这些问题，可以优化反应条件或重新设计引物。

尊龙凯时致力于创新和质量，提供先进的生物医药产品，我们的技术支持和优质服务将帮助您在科研道路上不断前进，推动基因治疗及细胞治疗的发展。