荧光定量PCR（Real-time PCR）是一种在PCR扩增反应体系中引入荧光基团的方法，通过实时检测每个循环的荧光信号并利用标准曲线对未知模板进行定量分析。在探针法荧光定量PCR中，PCR扩增时会加入一对引物和一个特异性的荧光探针。该探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团。在扩增反应初期，探针与DNA链结合，报告基团的荧光信号被淬灭，未能被检测到。然而，随着PCR的进行，Taq酶会降解探针，导致荧光信号得以释放，从而实现荧光信号的累积，反映PCR产物的生成。

传统PCR技术在扩增后需要进行染色和电泳分离，主要用于定性分析，且易受污染影响，带来假阳性结果，这限制了其应用。而实时定量PCR技术不仅能够实现模板的定量，还具备高灵敏度、特异性和可靠性等优点，提高了自动化程度，避免了污染，因此越来越多地取代了常规PCR。

在PCR扩增的初始几个循环中，荧光信号变化较小，处于基线状态。之后，反应进入指数增长期，此时的扩增曲线具有高度的重复性。在这一阶段，可以设定荧光阈值线，该阈值通常设定为3-15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。当每个反应管中的荧光信号达到设定阈值时，所经历的循环数称为CT值。CT值与起始浓度的对数呈线性关系，且该值具有重现性，主要用于计算目标基因的表达量。

在荧光定量PCR中，存在绝对定量和相对定量两个概念。绝对定量旨在测定样本中目标基因的分子数目，即拷贝数；相对定量则测定在不同样本中目标基因的相对比例，而不需知晓每个样本的拷贝数。尽管CT值可用于计算这两种结果，但绝对定量实验需要使用已知拷贝数的标准品并进行标准曲线绘制，而相对定量实验则可以选择不使用标准曲线。这使得很多实验室倾向选择相对定量的方法来分析基因表达量。基于实时荧光定量PCR的技术，自其诞生以来，对于生物医学研究发挥了重要作用，涉及多个领域。

荧光定量PCR的重要应用领域

1. 核酸定量分析：用于传染性疾病的定量与定性分析，检测病原微生物或病毒的含量，如甲型H1N1流感、转基因动植物基因拷贝数、RNAi基因失活率等。

2. 基因表达差异分析：比较经过不同处理样本中特定基因的表达差异，以及在不同时相的表达变化，确认cDNA芯片或差异表达结果。

3. SNP检测：检测单核苷酸多态性，以研究个体对不同疾病的易感性以及对特定药物的反应，一旦SNP序列已知，使用该技术进行高通量检测将更为简单与准确。

4. 甲基化检测：甲基化现象与多种疾病，特别是癌症有关。例如，Methylight技术能够区分甲基化与非甲基化DNA，且具有高灵敏度。

5. 产前诊断：通过实时荧光定量PCR技术检测胎儿DNA，以无创的方式判断胎儿性别等，从而减少遗传性疾病的发生。

6. 病原体检测：对淋球菌、沙眼衣原体等多种病原体进行定量检测，其敏感性高于传统方法，且快速、简便。

7. 药物疗效评估：分析HBV和HCV的病毒量与药物疗效的关系，为评估疗效提供重要依据。

8. 肿瘤基因检测：有效检测基因突变，以及癌基因的表达量，为肿瘤分子机制研究和早期诊断提供了强有力的工具。

总的来说，尊龙凯时的荧光定量PCR技术在生物医疗领域的广泛应用，推动了各类疾病的早期诊断及治疗，为医学研究带来革命性的影响。